微生物耐药性检测方法

3.1 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)检测耐药性

在对消毒剂的研究中，通过测定菌株消毒剂的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)来判断其耐药性。一般认为，如果其MIC值高于标准菌株，则可认为该菌产生了消毒剂抗性。该方法操作较简单，结果重复性高，为目前研究消毒剂抗性应用最多的方法。

表1 常用评价方法

3.2 耐消毒剂基因检测

国内外目前也以检测细菌的耐消毒剂基因来判断对消毒剂的耐受性，具体方法包括实时荧光定量 PCR( real-time PCR)^[13]、多位点序列分型、质粒DNA图谱分型技术等，也可以从生物大分子的角度研究耐消毒剂基因的表达，揭示耐消毒剂的机制^[2]。例如，可以利用质谱分析技术检测耐消毒剂细菌外膜蛋白的表达变化，也可以通过色谱技术检测耐消毒剂细菌表面的脂质或脂肪酸的分布，从而揭示细菌对消毒剂的抗性机制^[2]。

图5 实时荧光定量 PCR机理^[13]

微生物对消毒剂耐药性控制措施

微生物适应能力很强，科学发展的同时微生物也在不断进化以适应环境改变，抵御各种灭菌措施，加强微生物对消毒剂的耐药性认识，加强环境消毒的标准化，合理规范使用消毒剂，应从以下几个方面应对消毒剂耐药性的影响：

4.1 选择合适的消毒剂作用浓度杀灭病菌

细菌在反复接触低剂量或亚致死剂量消毒剂情况下，每次使用消毒剂会受到选择压力的作用，都可能促成细菌生态学的改变，就会更容易产生抗性，这也是细菌对消毒剂产生抗性的重要因素^[14]。在尽量保护环境的情况下，以超过MBC 的剂量，一次性将致病菌全部杀死为宜，对细菌产生杀灭作用，而不是抑制作用，从而减少耐消毒剂细菌的出现和传播^[2]。

4.2 交替使用不同作用机理的消毒剂

有的消毒剂作用机理大致相同，如季铵盐碘消毒液和聚维酮碘溶液消灭细菌的作用机理就基本一样，即：碘卤化菌体的蛋白质后会产生沉淀；细胞膜与表面活性剂易产生亲和作用，将载有的碘与细胞膜、细胞质等物质相结合，使巯基化合物、肽、蛋白质、酶、脂质等氧化或者碘化最终达到了杀灭细菌的作用。而癸甲溴铵溶液与季铵盐碘消毒液、聚维酮碘溶液的作用机理则有所区别，癸甲溴铵溶液属于阳离子表面活性剂，可降低菌体表面张力增加菌体细胞膜的通透性，从而导致菌体中重要的酶和营养物质等的流失，使水渗入菌内，让菌体溶解或者破裂^[15]。所以，规模化养殖场进行环境消毒时应尽量避免长期使用单一消毒剂。经常更换消毒药的种类，以联合使用多种处理方法协同作用来更彻底地消除有害微生物，可避免动物舍内的细菌产生耐药性，提高消毒效果。

4.3 选择合适的消毒剂

由于缺乏相关常识, 往往会错误地认为只要使用消毒剂消毒既能够杀灭所有细菌, 造成了消毒剂的大量的滥用。因消毒剂的使用类型不当, 致使消毒剂本身对所要杀灭的细菌无杀灭作用，即相当于强化了细菌对该类消毒剂的适应性，从而增加细菌耐药性的产生。所以，在使用消毒剂前应首先判定所处环境被何种细菌、病毒、疫病污染的程度或根据所要预防疫病的种类，有目的的选择适合种类的消毒剂进行消毒^[16]。以下简单列举常用的一些消毒剂适用范围：

表2 根据消毒对象选择适宜类型的消毒剂^[17]

要进行密闭效果好的空的圈、舍、笼、房间的消毒，可选择甲醛或戊二醛熏蒸的方法，密闭性较差的可选择喷洒消毒方式。对耐腐蚀的物体表面可用喷洒的方法，对不耐腐蚀的物体用无腐蚀的化学消毒剂喷洒、擦拭等方式消毒。

4.4 加强耐药性机制研究

关于细菌耐受消毒剂的抗性机理尚未完全清楚，微生物对消毒剂抗性机制以及调控措施的研究还在不断探索中。加强细菌对消毒剂的抗性机理研究，有利于消毒剂的合理应用，对消除已出现的细菌对消毒剂抗性意义重大，同时有利于开发新的作用机制的消毒剂。在了解消毒剂杀菌机理基础上，科学复配消毒剂，通过消毒剂与消毒剂的复方或通过消毒剂与助剂的复配，提高杀菌效果。

如戊二醛属于高效消毒剂，但其不耐有机物干扰，而与季铵盐类消毒剂复方，在戊二醛溶液中加入适量的表面活性剂可获得多组分的配伍协同灭菌效果，可以显著提高消毒效果。戊二醛与苯扎溴铵复方，苯扎溴铵与细菌细胞壁上的多磷脂反应，使细菌细胞壁上的肽变性，随后戊二醛破坏细菌表面的蛋白受体，同时苯扎溴铵具有降低溶液界面张力、增强消毒剂在消毒物体表面上的润湿作用，使戊二醛与病原体微生物充分接触，提高戊二醛对菌体的渗透能力^[18]。二者联合实现消毒灭菌过程的互补，充分发挥杀灭效果，避免了各自单独使用时的限制条件。

图6 戊二醛苯扎溴铵复方协同作用示意图

讨论与展望

现目前国内外对消毒剂耐药性研究仍比较少，相关文献报道并不多。微生物对消毒剂耐药性机制较为复杂，且有些耐药性是多种机制交叉作用/共耐药^[19]的结果，但关于交叉/共耐药机制的研究甚少，这也是未来研究重点。尽管目前尚未有明确研究发现消毒剂对微生物有显著失效的现象，而现如今越来越多的研究显示，在消毒剂长期压力下，微生物对消毒剂的抗力增加体现在MIC和MBC提高，在实际使用需要提高原来常规使用浓度才能有好的消毒效果。在今后研究中仍应加强开展微生物消毒剂耐药性、抗性相关基因及耐药性产生机制的相关研究，深入探索微生物对消毒剂抗性的产生和传播机理，为科学有效使用消毒剂、降低消毒剂耐药性风险提供相关理论和数据支撑。

图7 消毒剂的作用机制及可能诱发抗菌药交叉/共耐药机制^[19]

参考文献

[13]安钢力.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用[J].中国现代教育装备,2018(21):19-21.

[14]何荣攀,马久红.铜绿假单胞菌生物膜对消毒剂抗性研究进展[J].中国消毒学杂志,2019,36(04):308-311.

[15]张国礼,马高民,金兰梅,徐云迪,朱彬.牛舍环境中大肠杆菌对常用消毒剂耐药性的研究[J].中国奶牛,2018(02):32-36.

[16]佟海山,陈遇英.浅谈兽用消毒剂的耐药性及对策[J].中国畜牧兽医文摘,2017,33(07):230.

[17]吴蕾,沈志勇,崔雪志,鲁守伟,许传田.五种不同种类消毒剂杀菌效果评估[J].家禽科学,2018(03):16-19.

[18]王宏翔,聂绍发.复方戊二醛消毒剂的复合增效作用[J].中国医院药学杂志,2006(06):763-764.

[19]郭金丽.弯曲菌对3种消毒剂的适应性及其诱发抗菌药交叉/共耐药机制研究[D].华中农业大学,2021.